En él, además de los genes propiamente dichos, se incluyen regiones espaciadoras, regiones reguladoras, genes que dejaron de ser funcionales y muchas otras secuencias de función o papel todavía desconocido. Además, el genoma es depositario de los cambios (mutaciones) que se han acumulado a lo largo de la
historia evolutiva de la especie y de todas sus antecesoras. En consecuencia, en el genoma se almacena información de inmediata utilidad para el organismo y otra que sirve como registro histórico de su especie y ancestros.
¿Para qué se estudian los genomas?
El estudio de los genomas de organismos de distintas especies y su comparación, permite obtener claves para comprender más de 3000 millones de años de evolución. La secuenciación de genomas de plantas y animales domésticos podría conducir a nuevos avances en la mejora agronómica y ganadera . También permitiría numerosas aplicaciones médicas y nuevos enfoques dentro de la biotecnología y la biología industrial.
Los primeros pasos
La secuenciación de ADN es un conjunto de métodos y técnicas bioquímicas cuya finalidad es la determina- ción del orden de los nucleótidos (A, C, G y T) en un fragmento de esta molécula. La primera generación
de técnicas para secuenciar el ADN empezó en 1975 con la metodología de Sanger y Coulson, llamada “más y menos” (del inglés, “plus and minus”), la cual necesitaba clonar cada fragmento inicial de “lectura” para producir un ADN de cadena simple.
En 1977, Maxam y Gilbert publicaron la metodología de secuenciación de ADN mediante degradación química. Este método estaba basado en la modificación química y posterior rotura del ADN (Figura 1), y empezó a ser el método de secuenciación más utilizado porque permitía utilizar un ADN purificado sin
necesidad de clonarlo.
Figura 1: método se secuenciación de Maxam y Gilbert (1977) Fuente: http://homepages.strath.ac.uk/~dfs99109/BB211/MGSeq.html
Explicación de la figura: (A) el método requiere marcaje radiactivo en uno de los extremos y la purificación del fragmento de ADN que se desea secuenciar. El tratamiento químico genera rupturas en una pequeña proporción de uno o dos de los cuatro nucleótidos en cada una de las cuatro reacciones (G, A+G, C, C+T). Luego, se realiza el tratamiento con piperidina a 90ºC para clivar el enlace azúcar-fosfato en los sitios orres- pondientes. De ese modo se genera una serie de fragmentos a partir del extremo marcado radiactivamente
hasta el primer lugar de corte en cada molécula. (B) Los fragmentos posteriormente se separan por tamaño mediante electroforesis en gel, separando los productos de las cuatro reacciones en cuatro calles del gel distintas. Para visualizar los fragmentos generados se hace una autoradiografía, lo que provee una imagen de una serie de bandas oscuras correspondientes a los fragmentos marcados con el radioisótopo. A partir de la lectura de estos fragmentos, desde abajo (fragmentos más pequeños) hacia arriba (fragmentos más grades) , se puede inferir la secuencia de ADN de interés.
En 1977 Sanger publicó su método de secuenciación de ADN por síntesis química llamado método de ter- minación de la cadena, el cual se convirtió en el método más utilizado en los siguientes 30 años. En este método se utilizan pocos reactivos tóxicos y cantidades menores de radiactividad que en el método de Maxam- Gilbert, y su característica particular es el uso de didesoxinucleótidos trifosfato (ddNTPs) como terminadores de la cadena de ADN.
Los ddNTPs son desoxinucleótidos de las 4 nucleótidos diferentes (dATP,dTTP, dCTP y dGTP) que carecen de uno de los grupos hidroxilo, de manera que cuando uno de estos nucleótidos se incorpora a una cadena de ADN en crecimiento, esta cadena no puede continuar elongándose ya que la enzima ADN polimerasa necesita un extremo 3’ OH para añadir el siguiente nucleótido, y el ddNTP incorporado carece
de este grupo hidroxilo (Figura 2). Al terminar la elongación de la cadena, se producen varios fragmentos de ADN de longitud variable, los cuales son desnaturalizados por calor y separados por tamaño (con una reso- lución de un solo nucleótido) mediante electroforesis en gel de poliacrilamida - urea. Cada una de las cuatro
reacciones de síntesis se corre en calles individuales (A, T, G y C) y se visualizan las bandas de ADN me- diante autoradiografía o luz ultravioleta. Las bandas obtenidas en el gel corresponden a los fragmentos de ADN de diferentes longitudes. Una banda en una calle indica un fragmento de ADN que es el resultado
de una terminación de la cadena tras la incorporación de un didesoxinucleótido (ddATP, ddGTP, ddCTP o ddTTP). El nucleótido terminal puede ser identificado de acuerdo al didesoxinucleótido que se añadió en la reacción que dio lugar a esa banda. Las posiciones relativas entre las cuatro calles se utilizan entonces para
leer (de abajo a arriba) la secuencia de ADN.
la secuenciación del ADN se utiliza para determinar el orden exacto de las bases en el ADN. El procedimiento utiliza la síntesis de ADN para producir copias de la secuencia diana muy parecida a la polimerización en cadena. Sin embargo, en lugar de sintetizar múltiples copias de la secuencia completa, algunos de los ejemplares se ven obligados a finalizar antes de llegar al final. De hecho, las condiciones se establecen de tal manera que un porcentaje de los ejemplares termina en cada una de las posiciones de base en la secuencia. Este método terminación de la cadena se logra mediante la adición de una pequeña proporción de dideoxinucleótidos (DdNTP) a la reacción de síntesis de ADN estándar, que contiene deoxinucleótidos (dNTPs). Dideoxinucleótidos se hayan modificado químicamente por un extremo por lo que se puede añadir a una nueva cadena, pero nada se puede añadir a ellos. Por lo tanto, el proceso de replicación se detiene cada vez que una de estas bases, se añade. Las copias resultantes, variando de solamente una base de longitud, están separados por electroforesis en un gel polyacrylimide. En caso de transformación de visualizar las copias, un patrón en escalera-como se ve, donde cada uno se retorcía de la escala representa una copia de ADN que difiere de ella por los vecinos de una base. Figura 2: método se secuenciación de Sanger (1977)
Fuente: Adaptado de National Biological Information Infrastructure (NNBI),
http://www.nbii.gov/portal/server.pt?open=512&objID=402&&PageID=571&mode=2&in_hi_userid=2&cached=true
En próxima entrada seguiré con el tema.
