Existen algunas variaciones del método de secuenciación de terminación de la cadena de Sanger que permiten la optimización de dicha técnica. Una de ellas es la secuenciación por terminador fluorescente, en la cual se marca cada uno de los cuatro ddNTPs que terminan la cadena con un colorante fluorescente diferente, los cuales fluorescen a diferentes longitudes de onda.
Se realizan cuatro reacciones de secuencia separadas, cada con un ddNTP terminador con una etiqueta fluorescente distinta. Después, los productos se mezclan y se someten a electroforesis en gel. Mientras que los fragmentos de ADN se desplazan a través del gel, pasan por un rayo láser que excita al compuesto fluorescente. La luz emitida es detectada por un fotomultiplicador, que está conectado con una computadora que colecta y analiza los datos (figura 3).
Fuente: The Cell a Molecular approach, 2ºEd. Geoffrey Cooper. Disponible en
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=cooper&part=A448#A461
El método de secuenciado por terminador fluorescente junto con analizadores de secuencia de ADN de alto rendimiento se utilizan en la actualidad para la mayoría de los proyectos de secuenciación, puesto que es más fácil de llevar a cabo y tiene un costo menor que los anteriores métodos de secuenciación.
La secuenciación de genomas a gran escala
La secuenciación a gran escala se refiere a conocer la secuencia de fragmentos muy grandes de ADN. Esto es necesario en cualquier proyecto genoma en donde el ADN puede estar formado por miles de nucleótidos (genomas bacterianos) a 200 millones de bases (Cromosoma 1 humano).
Dentro de las principales formas de secuenciar a gran escala el genoma, se pueden mencionar dos procedimientos:
• Secuenciación jerárquica (hierarchical shotgun sequencing): el primer paso consiste en construir una “genoteca” por fragmentación del ADN e introducción del mismo en vectores que aceptan grandes insertos, en este caso de BACs. Los fragmentos de ADN representados en la genoteca son organizados en un mapa físico y los clones individuales son seleccionados y secuenciados para lo cual se hace una nueva genoteca de trozos más pequeños («shotgun library»). La secuencia de los clones se ensambla
finalmente para reconstruir la secuencia del genoma (figura 4 a)
http://www.argenbio.org/adc/uploads/libro/22_VII_1.pdf
• Secuenciación de genomas completos (whole genome shotgun sequencing):
En este método el genoma completo es cortado en pequeños fragmentos de ADN. A diferencia del método anterior no se utilizan mapas físicos como referencia para ordenar los fragmentos. Así, cada fragmento es secuenciado primero y las secuencias solapantes se ubican juntas para crear
un contiguo. Para lograr el solapamiento, los fragmentos de ADN deben ser secuenciados varias veces (Figura 4 b)
Figura 4: métodos de secuenciación a gran escala. A) secuenciación jerárquica. B) secuenciación de genoma completo.
Nuevos métodos de secuenciación: secuenciación de alto rendimiento
La elevada demanda de secuenciación de bajo costo ha dado lugar a distintas tecnologías de secuenciación de alto rendimiento. Estos emprendimientos han sido financiados por instituciones públicas y privadas así como desarrolladas y comercializadas por empresas privadas. Éstas permiten una secuenciación más barata y eficiente, a pesar de obtener fragmentos de menor tamaño. Así, las
secuencias obtenidas requieren el empleo de potentes herramientas informáticas para su ensamblaje. Actualmente, los sistemas de nueva generación disponibles en el mercado son el método 454 de Roche, Solexa de Illumina y SOLiD de Applied Biosystems.
La mayoría de los métodos utilizan un paso con clonación in vitro para generar muchas copias de cada molécula individual, ya que los métodos de detección molecular frecuentemente no son lo suficientemente sensibles para la secuenciación de una sola molécula.
Uno de los métodos es la PCR de emulsión, en la que se aíslan las moléculas individuales de ADN junto con microesferas. Luego, mediante una reacción de PCR se recubre cada microesfera con copias clonales de la biblioteca de moléculas aisladas y seguidamente se inmovilizan para ser más tarde secuenciadas. La PCR de emulsión se usa en los métodos 454 Life Sciences (adquirido por Roche) (Figura 5),"secuenciación polony (término formado por polimerasa "pol" y colonia "colony"), y la secuenciación SOLiD (adquirida por Applied Biosystems).
Otro método para la amplificación clonal in vitro es la PCR de puente, en la que los fragmentos se amplifican a partir de los cebadores unidos a una superficie sólida, desarrollados y usados por el método Solexa (adquirida por la empresa Illumina).
Estos métodos producen muchas copias de un solo fragmento localizadas físicamente en forma aislada una de otras.
Una vez que las secuencias clonales de ADN se localizan físicamente en posiciones separadas de la superficie, se pueden utilizar diferentes métodos de secuenciación para determinar las secuencias de ADN de todas las localizaciones en paralelo. La secuenciación por síntesis, como en la popular secuenciación electroforética con terminador marcado con colorante, usa el proceso de síntesis de ADN usando la enzima ADN polimerasa para identificar las bases presentes en la molécula
complementaria de ADN. En cambio, en la secuenciación por ligación se emplea una ADN ligasa en lugar de una polimerasa para identificar la secuencia objetivo.
Figura 5: Esquema del método de secuenciación 454
Fuente: Roche. http://www.roche-appliedscience.com/publications/multimedia/genome_sequencer/flx_multimedia/wbt.htm
La comparación de estos métodos de secuenciación de alto rendimiento se pueden
observar en la siguiente tabla:
